Dûbelstrengige RNA (dsRNA) ELISA KIT

Dizze kit is in Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) keppeling mei biotin-Streptavidin systeem, foar kwantitative mjitting fan dsRNA mei lingte boppe 60 base pearen (bp), nettsjinsteande de folchoarder.De plaat is foarbeklaaid mei anty-dsRNA antykodyk.dsRNA oanwêzich yn it stekproef wurdt tafoege en bynt oan antykladen coated op 'e putten.En dan wurdt biotinylearre anty-dsRNA antykodym tafoege en bynt oan dsRNA yn 'e stekproef.Nei it wassen wurdt HRP-Streptavidin tafoege en bynt oan it Biotinylated anty-dsRNA antykodym.Nei ynkubaasje wurdt unbound HRP-Streptavidin fuortwosken.Dan wurdt TMB-substraatoplossing tafoege en katalysearre troch HRP om in blauwe kleurprodukt te produsearjen dat feroare yn giel nei it tafoegjen fan soere stopoplossing.De tichtens fan giel is evenredich mei de doelhoeveelheid fan dsRNA fongen yn plaat.De absorbânsje wurdt metten by 450 nm.

Oanfraach

Dizze kit is foar kwantitative mjitting fan oerbleaune dsRNA.

Kit komponinten

Opslach en stabiliteit

1. Foar net brûkte kit: De hiele kit koe wurde opslein op 2 ~ 8 ℃ yn hâldberens.Sterk ljocht moat foarkommen wurde foar opslachstabiliteit.

2. Foar brûkte kit: Sadree't de mikroplaat iepene is, dekke asjebleaft net brûkte putten mei plaatsealer en gean werom nei de foliepûde mei it desiccantpakket, zip-seal de foliepûde en werom nei 2 ~ 8 ℃ sa gau mooglik nei gebrûk.Oare reagents moatte sa gau mooglik nei gebrûk werombrocht wurde nei 2 ~ 8 ℃.

Materialen nedich mar net levere

1. Microplate reader mei 450 ± 10nm filter (better as kin detect op 450 en 650 nm golflingte).

2. Microplate shaker.

3. RNase-frije tips en centrifuge buizen.

Operaasje Flowchart

Foardat jo begjinne

1. Bring alle kitkomponinten en samples nei keamertemperatuer (18-25 ℃) foar gebrûk.As de kit sil net brûkt wurde yn ien kear, nim dan asjebleaft allinne út strips en reagents foar hjoeddeiske eksperimint, en lit de oerbleaune strips en reagents yn fereaske steat.

2. Waskbuffer: ferwiderje 40mL fan 20 × konsintrearre waskbuffer mei 760mL fan deionisearre of destillearre wetter om 800mL fan 1 × waskbuffer te meitsjen.

3. Standert: koart spin of centrifuge de stock oplossing foar gebrûk.De konsintraasje fan fjouwer levere noarmen is 5ng / μL.Foar UTP- en pUTP dsRNA-standerts, ferwiderje de stockoplossing asjebleaft nei 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg / μL mei STE-buffer om de standertkromme te tekenjen.Foar N1-Me-pUTP dsRNA-standerts, ferwiderje de stockoplossing asjebleaft nei 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg / μL mei STE-buffer om de standertkromme te tekenjen.Foar 5-OMe-UTP dsRNA-standert, ferwiderje de stockoplossing asjebleaft nei 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg / μL mei STE-buffer om de standertkromme te tekenjen.Wy riede oan dat noarmen kinne wurde verdund as folgjende diagrammen:

4. Biotinylearre deteksje-antybody en HRP-streptavidin-wurkoplossing: koart spin of sintrifuge de stockoplossing foar gebrûk.Ferwiderje se nei de wurkjende konsintraasje mei dilutionbuffer.

5. TMB substate: aspirearje de nedige dosaasje fan 'e oplossing mei sterilisearre tips en dump de oerbleaune oplossing net wer yn' e vial.TMB substate is gefoelich foar ljocht, bleatstelje TMB substraat net foar in lange tiid oan ljocht.

It brûken fan protokol

1. Bepale it oantal strips nedich foar de assay.Foegje de strips yn 'e frames foar gebrûk.Oerbleaune plaat strips net brûkt yn dizze assay moatte wurde ferpakt yn de tas mei desiccant.Slút de tas goed foar gekoelde opslach.

2. Add 100μL elk fan dilutions fan standert, blank en samples yn de passende wellen.Cover mei de plaat sealer.Inkubearje foar 1 oere by keamertemperatuer mei skodzjen by 500 rpm.De samples moatte wurde verdund mei STE-buffer oant passende konsintraasje foar krekte assay.

3. Waskje stap: Aspirearje de oplossing en waskje mei 250μL waskbuffer nei elk goed en lit it stean foar 30s.Werje de waskbuffer folslein ôf troch de plaat op absorberend papier te snapjen.Hielendal 4 kear waskje.

4. Add 100μL fan biotinylated detection antibody wurkje oplossing yn elke put.Cover mei de plaat sealer.Inkubearje foar 1 oere by keamertemperatuer mei skodzjen by 500 rpm.

5. Werhelje waskjen stap.

6. Foegje 100μL fan HRP-streptavidin-wurkoplossing yn elke boarne.Cover mei de plaat sealer.Incubate foar 30min by keamertemperatuer mei shaking by 500rpm.

7. Werhelje de waskstap wer.

8. Add 100μL fan TMB substraat oplossing yn elke boarne.Cover mei de plaat sealer.Incubate foar 30 min by RT Beskermje fan ljocht.De floeistof sil blau wurde troch it tafoegjen fan substraatoplossing.

9. Foegje 50μL fan stop-oplossing yn elke boarne.De floeistof sil giel wurde troch it tafoegjen fan stopoplossing.Rin dan de mikroplaatlêzer út en fier mjitting op 450nm fuortendaliks.

Berekkening fan resultaten

1. Gemiddeld de dûbele lêzingen foar elke standert, kontrôle en samples en subtract de gemiddelde nul standert optyske tichtens.Konstruearje in standertkromme mei absorbânsje op 'e fertikale (Y) as en dsRNA-konsintraasje op' e horizontale (X) as.

2. It is oan te rieden om te fieren de berekkening mei kompjûter-basearre curve-fitting software lykas curve expert 1.3 of ELISA Calc yn in 5 of 4 parameter net-lineêre fit model.

Optreden

1. Gefoelichheid:

legere limyt fan deteksje: ≤ 0.001pg/μL (foar UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0.01pg/μL (foar 5-OMe-UTP-dsRNA).

legere limyt fan kwantifikaasje: 0.0156 pg/μL (foar UTP-, pUTP-dsRNA), 0.0312 pg/μL (foar N1-Me-pUTP-dsRNA), 0.0625 pg/μL (foar 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Precision: CV fan Intra-Assay ≤10%, CV fan Inter-Assay ≤10%

3. Herstel: 80%~120%

4.Lineariteit: 0.0156-0.5pg/μL (foar UTP-, pUTP-dsRNA) 0.0312-1pg/μL (foar N1-Me-pUTP dsRNA), 0.0625-1pg/μL (foar 5-OMe-UTP-dsRNA).

Oerwagings

1. TMB-reaksjetemperatuer en tiid is kritysk, kontrolearje se asjebleaft neffens de ynstruksje strikt.

2. Om goede assay reproducibility en gefoelichheid te berikken, goede waskjen fan de platen te ferwiderjen oerstallige un-reagearre reagents is essinsjeel.

3. Alle reagents moatte wurde mingd yngeand foar gebrûk en foarkomme bumbles by sample of reagents tafoeging.

4. As kristallen binne foarme yn 'e konsintrearre waskbuffer (20x), waarmje oant 37 ℃ en mingje sêft oant de kristallen folslein oplost binne.

5. Avoid assay fan samples befetsje Sodium Azide (NaN3), as it koe ferneatigje de HRP aktiviteit resultearret yn ûnderskatting fan it bedrach fan dsRNA.

6. Avoid RNase fersmoarging tidens assay.

7. De standert / sample, detection antibody en SA-HRP kin ek wurde útfierd by RT sûnder shaking, mar dit kin feroarsaakje detection gefoelichheid ôfnimme troch ien kear.Foar dit gefal advisearje wy dat UTP en pUTP dsRNA-standerts moatte wurde verdund fan 2pg/μL, N1-Me-pUTP dsRNA-standerts moatte wurde verdund fan 4pg/μL en 5-OMe-UTP dsRNA-standert moat wurde verdund fan 8pg/μL.Dêrneist, incubate HRP-streptavidin wurkje oplossing foar 60min by keamertemperatuer.Brûk gjin flask shaker, om't flask shaker kin resultearje yn in krekt resultaat.

Typysk resultaat

1. Standert kromme gegevens

2. Standert kromme berekkening

3. Liner detection berik: 0.0312- 1pg / μL