mRNA Cap2'-O-Methyltransferase
mRNA Cap 2' -O-methyltransferase waard ôflaat fan in rekombinante E. coli-stam dy't it gen foar de vaccinia mRNA Cap 2 '-O-Methyltransferase draacht.Dit enzyme foeget in methylgroep ta oan 'e 2'-O-posysje fan' e earste nukleotide neist de kapstruktuer oan 'e 5'ein fan it RNA. -0) resultearret yn in cap- 1 struktuer.
De Cap1 struktuer kin fergrutsje de oersetting effisjinsje, it ferbetterjen fan de ekspresje fan mRNA yn transfection en microinjection eksperiminten.Dit enzyme spesifyk fereasket RNA mei in m7GpppN cap as substraat.It kin RNA net brûke mei pN, ppN, pppN of GpppN oan it 5' ein.Capped RNA kin wurde taret fia in vitro-transkripsje mei cap-analog of fia enzymatyske capping mei it Vaccinia Capping Enzyme.
Components
mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase (50U/μL)
10 × Capping Reaction Buffer
Opslach
-25 ～- 15 ℃ foar opslach （ Foarkom werhelle freeze-dooi-syklusen）
Opslach buffer
20 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25 ℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0, 1 mM EDTA, 0, 1% Triton X-100, 50% glycerol.
Unit definysje
Ien ienheid wurdt definieare as de hoemannichte enzyme dy't nedich is om 10 pmoles fan 80 nt capped RNA-transkript yn 1 oere by 37 ° C te methylearjen.
Assays foar kwaliteitskontrôle
Exonuclease: 50U fan mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase mei 1μg λ-Hind III digest DNA by 37 ℃ foar 16 oeren jout gjin degradaasje lykas bepaald troch agarose gel elektroforese.
Endonuklease: 50 U fan mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase mei 1 μg λDNA by 37 ℃ foar 16 oeren jout gjin degradaasje lykas bepaald troch agarosegelelektroforese.
Nickase: 50U fan mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase mei 1μg pBR322 by 37 ℃ foar 16 oeren jout gjin degradaasje lykas bepaald troch agarosegelelektroforese.
RNase: 50U fan mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase mei 1.6μg MS2 RNA foar 4 oeren by 37 ℃ jout gjin degradaasje lykas bepaald troch agarosegelelektroforese.
E. coli DNA: 50U fan mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase wurdt screened foar de oanwêzigens fanE. coli genomic DNA mei TaqMan qPCR mei primers spesifyk foar deE. coli 16S rRNA-lokus.DeE. coli genomyske DNA-kontaminaasje is =1E. coli genom.
Baktearje Endotoxine: LAL-test, neffens Sineeske Pharmacopoeia IV 2020-edysje, gellimyttestmetoade, algemiene regel (1143).De ynhâld fan bakteriële endotoxine moat = 10 EU/mg wêze.
Reaksjesysteem en betingsten
1. Kombinearje in passende hoemannichte Capped RNA en RNase-frije H2O yn in 1.5 mL mikrofuge-buis nei in lêste folume fan 16.0 µL.
2. Heat op 65 ℃ foar 5 minuten folge troch in iisbad foar 5 minuten.
3. Foegje de folgjende komponinten ta yn 'e oantsjutte folchoarder (foar methylaasje fan Capped RNA
minder as 10
| Komponint | Folume |
| Denatured capped RNA | 16 μL |
| 10X Capping Reaction Buffer* | 2 μl |
| SAM (4 mM) | 1 μl |
| mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase (50 U/μL) | 1 μl |
| ddH2O | Oant 20 μL |
*10 × Capping Reaction Buffer: 500 mM Tris-HCl (pH 8.0, 25 ℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.
4. Inkubearje by 37 ℃ foar 1 oere (2 oeren ynkubaasje wurdt oanrikkemandearre foar it doelfragmint minder dan 200 nt).
Oanfraach
Om mRNA-ekspresje te ferbetterjen tidens mikro-ynjeksje en transfeksje-eksperiminten.
Notysjes oer gebrûk
1. Foardat reaksje moat RNA wurde suvere en oplost yn nukleasefrij wetter, alle oplossingen moatte gjin EDTA en ioanen befetsje.
2. It is oan te rieden om de sample RNA op 65 ℃ foar 5 min foar de reaksje te ferwaarmjen om de sekundêre struktuer op it 5'ein fan 'e transkript te ferwiderjen.It koe wurde ferlingd nei 10 min foar komplekse 5' -terminalstruktuer.
