PNGase F
Peptide-N-Glycosidase F (PNGase F) is de meast effektive enzymatyske metoade foar it fuortheljen fan hast alle N-keppele oligosaccharides út glycoproteins.PNGase F is in amidase, dy't spalt tusken de binnenste meast GlcNAc en asparagineresten fan hege mannose, hybride en komplekse oligosaccharides fan N-keppele glycoproteins.
Oanfraach
Dit enzyme is nuttich foar it fuortheljen fan koalhydraatresten út aaiwiten.
Tarieding en spesifikaasje
| Ferskining | Kleurleaze floeistof |
| Protein suverens | ≥95% (fan SDS-PAGE) |
| Aktiviteit | ≥500.000 U/mL |
| Exoglycosidase | Gjin aktiviteit koe wurde ûntdutsen (ND) |
| Endoglycosidase F1 | ND |
| Endoglycosidase F2 | ND |
| Endoglycosidase F3 | ND |
| Endoglycosidase H | ND |
| Protease | ND |
Eigenskippen
| EC nûmer | 3.5.1.52(Rekombinant út mikroorganisme) |
| Molekuul gewicht | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Isoelektrysk punt | 8. 14 |
| Optimale pH | 7,0-8,0 |
| Optimale temperatuer | 65 °C |
| Substraat spesifisiteit | Cleaving glycosidic obligaasjes tusken GlcNAc en asparagine resten Fig.1 |
| Erkenning sites | N-keppele glycanen útsein as se befetsje α1-3 fucose Fig. 2 |
| Aktivators | DTT |
| Inhibitor | SDS |
| Storage temperatuer | -25 ~-15 ℃ |
| Heat Inactivation | In 20µL reaksjegemik mei 1µL PNGase F wurdt ynaktivearre troch ynkubaasje by 75 °C foar 10 minuten. |
Fig. 1 Substraat spesifisiteit fan PNGase F
Fig. 2 Erkenning sit fan PNGase F.
As de ynterne GlcNAc-residuen keppele binne oan α1-3-fucose, kin PNGase F net N-keppele oligosaccharides fan glycoproteins ôfsplitse.Dizze modifikaasje is gewoan yn planten en guon ynsekten glycoproteins.
Componenten
|
| Components | Konsintraasje |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | 10 × Glycoprotein Denaturing Buffer | 1000 µl |
| 3 | 10×GlycoBuffer 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
Unit definysje
Ien ienheid (U) wurdt definiearre as de hoemannichte enzyme nedich om> 95% fan it koalhydraat te ferwiderjen fan 10 µg denaturearre RNase B yn 1 oere by 37 ° C yn in totale reaksjevolumint fan 10 µL.
Reaksje betingsten
1.Dissolve 1-20 µg fan glycoprotein mei deionisearre wetter, add 1 µl 10 × Glycoprotein Denaturing Buffer en H2O (as nedich) om in 10 µl totale reaksjevolumint te meitsjen.
2.Inkubearje op 100 ° C foar 10 min, koelje it op iis.
3.Foegje 2 µl 10 × GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 ta en mingje.
4.Foegje 1-2 µl PNGase F en H ta2O (as nedich) om in 20 µl totale reaksjevolumint te meitsjen en mingje.
5.Incubate reaksje op 37 ° C foar 60 min.
6.Foar SDS-PAGE-analyze as HPLC-analyze.
