Proteinase K NGS (poeder)
Cat No: HC4507A
NGS Protease K is in stabile serine protease mei hege enzym aktiviteit en brede substraat specificity.The enzyme foarkar decomposes ester obligaasjes en peptide obligaasjes neist de C-terminal fan hydrofobe aminosoeren, sulfur-befette aminosoeren en aromaatyske aminosoeren.Dat, it wurdt faak brûkt om aaiwiten te degradearjen yn koarte peptiden.NGS Protease K is in typysk serineprotease mei de Asp39-Syn69- Ser224katalytyske triade dy't unyk is foar serineproteasen, en it katalytyske sintrum wurdt omjûn troch tow Ca2+binende siden foar stabilisaasje, behâld fan hege enzymaktiviteit ûnder in breder skala oan omstannichheden.
Spesifikaasje
| Ferskining | Wyt oant off-wyt amorf poeder, lyofilisearre |
| Spesifike aktiviteit | ≥40U/mg fêst |
| DNase | Gjin ûntdutsen |
| RNase | Gjin ûntdutsen |
| Bioburden | ≤50CFU/g fêst |
| Nucleic acid residu | <5 pg/mg fêst |
Eigenskippen
| Boarne | Tritirachium album |
| EC nûmer | 3.4.21.64(Rekombinant út Tritirachium album) |
| Molekuul gewicht | 29 kDa (SDS-PAGE) |
| Isoelektrysk punt | 7.81 Fig.1 |
| Optimale pH | 7.0-12.0 (Alle fiere hege aktiviteit) Fig.2 |
| Optimale temperatuer | 65℃ Fig.3 |
| pH Stabiliteit | pH 4,5-12,5 (25℃,16h) Fig.4 |
| Termyske stabiliteit | Under 50 ℃ (pH 8.0, 30 min) Fig.5 |
| Storage stabiliteit | Opslein by 25 ℃ foar 12 moannen Fig.6 |
| Aktivators | SDS, urea |
| Inhibitoren | diisopropylfluorfosfaat;benzylsulfonylfluoride |
Storage Betingsten
Bewarje it lyofilisearre poeder by -25 ~ -15 ℃ foar in lange tiid fuort fan ljocht;Nei ûntbining, aliquot yn passend folume foar koarte termyn opslach by 2-8 ℃ fuort fan ljocht of lange termyn opslach by -25 ~ -15 ℃ fuort fan ljocht.
Foarsoarchsmaatregels
Draach beskermjende wanten en bril by it brûken of weagjen, en hâld goed fentilearre nei gebrûk.Dit produkt kin hûdallergyske reaksjes en serieuze eachirritaasje feroarsaakje.As ynademe kin it allergie of astma-symptomen of dyspnoe feroarsaakje.Kin respiratory irritation feroarsaakje.
Unit definysje
Ien ienheid fan NGS Protease K wurdt definiearre as de hoemannichte enzyme nedich om kasein te hydrolysearjen yn 1 μmol L-tyrosine ûnder standert betingsten.
Reagents tarieding
| Reagens | Fabrikant | Katalogus |
| Kasein technyskefan bovine molke | Sigma Aldrich | C7078 |
| NaOH | It bedriuw Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4·2H2O | It bedriuw Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | It bedriuw Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040618 |
| Trichloroacetic acid | It bedriuw Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 80132618 |
| Natrium acetate | It bedriuw Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10018818 |
| Jittiksoer | It bedriuw Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | It bedriuw Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10011018 |
| Natrium karbonaat | It bedriuw Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019260 |
| Foline-fenol | Sangon Biotech (Shanghai)Co., Ltd. | A500467-0100 |
| L-tyrosine | Sigma | 93829 |
Reagens I:
Substraat: 1% kasein út bovine molke oplossing: oplosse 1g bovine molke caseïne yn 50ml fan 0.1M natrium phosphate oplossing, pH 8.0, waarmte yn wetter bad op 65-70 ° C foar 15 minuten, roer en oplosse, cool mei wetter, oanpast troch natriumhydroxide oant pH 8.0, en ferdylgje yn 100ml.
Reagens II:
TCA oplossing: 0.1M trichloroacetic acid, 0.2M natrium acetate en 0.3M acetic acid (weagje 1.64g trichloroacetic acid + 1.64g natrium acetate + 1.724mL acetic acid opienfolgjende, add 50mL deionized wetter, oanpasse mei HCl03 oan pH03. 100 ml).
Reagens III:
0.4m natriumkarbonaatoplossing (weagje 4.24g wetterfrij natriumkarbonaat en oplost yn 100mL wetter)
Reagens IV:
Folin phenol reagens: verdund 5 kear mei deionized wetter.
Reagens V:
Enzym diluent: 0,1 M natriumfosfaatoplossing, pH 8,0.
Reagens VI:
L-tyrosine standert oplossing: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol / ml L-tyrosine oplost mei 0,2M HCl.
Proseduere
1. Skeakelje de UV-Vis spektrofotometer en selektearje fotometryske mjitting.
2. Stel de golflingte as 660nm.
3. Skeakelje it wetterbad, set de temperatuer op 37 ℃, soargje foar de temperatuer ûnferoare foar 3-5mins.
4. Preheat 0.5mL substraat yn in 2mL centrifuge tube by 37 ℃ wetterbad foar 10mins.
5. Extract 0.5mL verdunde enzyme oplossing yn 'e preheated sintrifuge buis foar 10 minuten.Set enzyme diluent as lege groep.
6. Add 1,0 mL TCA reagens fuortendaliks nei de reaksje.Mix goed en incubate yn wetter bad foar 30 minuten.
7. Centrifugate reaksje oplossing.
8. Foegje de folgjende komponinten ta yn 'e oantsjutte folchoarder.
| Reagens | Folume |
| Supernatant | 0,5 ml |
| 0.4M natriumkarbonaat | 2,5 ml |
| Folin fenol reagens | 0,5 ml |
9. Mix goed foar incubating yn wetter bad in 37 ℃ foar 30 minuten.
10. OD660waard bepaald as OD1;lege kontrôle groep: Enzym diluent wurdt brûkt om te ferfangen enzyme oplossing foar in bepalen OD660as OD2, ΔOD=OD1-OD2.
11. L-tyrosine standert kromme: 0.5mL ferskillende konsintraasje L-tyrosine oplossing, 2.5mL 0.4M natrium karbonaat, 0.5mL Folin fenol reagens yn 5mL centrifuge buis, incubate yn 37 ℃ foar 30mins, detect foar OD660foar ferskillende konsintraasje fan L-tyrosine, dan krige de standert kromme Y = kX + b, wêrby't Y is de L-tyrosine konsintraasje, X is OD600.
Berekkening
2: Totaal folume fan reaksje oplossing (mL)
0,5: Volume fan enzyme oplossing (ml)
0.5: Reaksje floeiber folume brûkt yn chromogenic bepaling (mL)
10: Reaksjetiid (min)
Df: Verdunning meardere
C: Enzymkonsintraasje (mg/ml)
Figures
Fig.1 DNA residu
| Foarbyld | Ave C4 | Nucleic acid Herstel (pg/mg) | Herstel (%) | Totaal Nucleic Acid ( pg/mg) |
| PRK | 24.66 | 2.23 | 83% | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126.728 | - | - |
| STD1 | 12.955 |
- |
- |
- |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| RNA-frije H2O | Unbepaald | - | - | - |
Fig.2 Optimale pH
Fig.3 Optimale temperatuer
Fig. 4 pH Stability
Fig.5 Thermal stabiliteit
Fig.6 Storage stabiliteit by 25 ℃
