Vaccinia Virus Capping Enzyme
Vaccinia virus capping enzyme is ôflaat fan in rekombinante E. coli stam draacht de genen foar de Vaccinia capping enzyme.Dit inkele enzym is gearstald út twa subunits (D1 en D12) en hat trije enzymatyske aktiviteiten (RNA triphosphatase en guanylyltransferase troch de D1 subunit en guanine methyltransferase troch de D12 subunit).Vaccinia virus Capping Enzyme is effektyf om de formaasje fan kapstruktuer te katalysearjen, dy't spesifyk de 7-methylguanylate capstruktuer (m7Gppp, Cap 0) oan 'e 5'-ein fan RNA kin hechtsje.Cap-struktuer (Cap 0) spilet in wichtige rol yn mRNA-stabilisaasje, ferfier en oersetting yn eukaryoten.It kapjen fan RNA troch enzymatyske reaksje is in effektive en ienfâldige metoade dy't de stabiliteit en oersetting fan RNA signifikant kin ferbetterje foar in vitro-transkripsje, transfeksje en mikroinjeksje.
Components
Vaccinia Virus Capping Enzyme (10 U/μL)
10 × Capping Buffer
Opslach betingsten
-25～- 15 ℃ foar opslach （ Foarkom werhelle freeze-dooi-syklusen）
Opslach buffer
20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,
1mM DTT, 0,1mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50% glycerol.
Unit Definition
Ien ienheid fan Vaccinia virus Capping Enzyme wurdt definiearre as de hoemannichte enzyme dy't nedich is om 10pmol GTP yn in 80nt transkript yn 1 oere by 37 °C op te nimmen.
Kwaliteitsbeweitsing
Exonuclease:10U fan Vaccinia virus Capping Enzyme mei 1μg λ-Hind III digest DNA by 37 ℃ foar 16 oeren jout gjin degradaasje lykas bepaald troch agarose gel elektroforese.
Endonuklease:10U fan Vaccinia virus Capping Enzyme mei 1μg λDNA by 37 ℃ foar 16 oeren jout gjin degradaasje lykas bepaald troch agarosegelelektroforese.
Nickase:10U fan Vaccinia virus Capping Enzyme mei 1 μg pBR322 by 37 ℃ foar 16 oeren jout gjin degradaasje lykas bepaald troch agarose gel elektroforese.
RNase:10U fan Vaccinia virus Capping Enzyme mei 1.6μg MS2 RNA foar 4 oeren by 37 ℃ jout gjin degradaasje lykas bepaald troch agarose gel elektroforese.
1.coli DNA:10U fan Vaccinia virus Capping Enzyme wurdt screened foar de oanwêzigens fan E. coli genomysk DNA mei TaqMan qPCR mei primers spesifyk foar de E. coli 16S rRNA locus.De E. coli genomyske DNA-kontaminaasje is ≤1 E. coli-genoom.
2.Baktearje Endotoxine: LAL-test, neffens Sineeske Pharmacopoeia IV 2020-edysje, gellimyttestmetoade, algemiene regel (1143).De ynhâld fan bakteriële endotoxine moat ≤10 EU/mg wêze.
Reaksjesysteem en betingsten
1. Capping Protocol (reaksje folume: 20 μL)
Dizze proseduere is fan tapassing op de capping-reaksje fan 10μg RNA (≥100 nt) en it kin wurde opskaald neffens eksperimintele easken.
I) Kombinearje 10μg RNA en Nuclease-frije H2O yn in 1.5 ml mikrofuge-buis nei in lêste folume fan 15.0 µL.*10×Capping Buffer: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)
2) Ferwaarmje op 65 ℃ foar 5 minuten folge troch iisbad foar 5 minuten.
3) Foegje de folgjende komponinten ta yn 'e oantsjutte folchoarder
| Component | Volume |
| Denatured RNA (≤10μg, lingte≥100 nt) | 15 μL |
| 10×Capping Buffer* | 2 μl |
| GTP (10 mM) | 1 μl |
| SAM (2 mM) | 1 μl |
| Vaccinia virus Capping Enzyme (10U/μL) | 1 μl |
*10×Capping Buffer: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)
4) Incubate by 37 ° C foar 30 minuten, RNA is no ôfsletten en klear foar streamôfwerts applikaasjes.
2. 5′ terminal labeling reaksje (reaksje folume: 20 μL)
Dit protokol is ûntworpen om RNA te labeljen mei in 5' trifosfaat en it kin wurde opskaald neffens easken.De effisjinsje fan it opnimmen fan labels sil wurde beynfloede troch de molêre ferhâlding fan RNA: GTP, lykas de GTP-ynhâld yn RNA-monsters.
1) Kombinearje passende hoemannichte RNA en Nuclease-frije H2O yn in 1.5 ml mikrofuge-buis oant in lêste folume fan 14.0 µL.
2) Ferwaarmje op 65 ℃ foar 5 minuten folge troch iisbad foar 5 minuten.
3) Foegje de folgjende komponinten ta yn 'e oantsjutte folchoarder.
| Component | Volume |
| Denaturearre RNA | 14 μL |
| 10 × Capping Buffer | 2 μl |
| GTP-mix** | 2 μl |
| SAM (2 mM) | 1 μl |
| Vaccinia virus Capping Enzyme (10U/μL) | 1 μl |
** GTP MIX ferwiist nei GTP en in lyts oantal markers.Foar de konsintraasje fan GTP, ferwizeoan notysje 3.
4) Inkubearje by 37 ° C foar 30 minuten, RNA 5' ein is no markearre en klear foar streamôfwerts
Oanfraach
1. Capping mRNA foarôfgeand oan oersetting assays / in vitro oersetting
2. Labeling 5' ein fan mRNA
Notysjes oer gebrûk
1.It ferwaarmjen fan de oplossing fan RNA foarôfgeand oan ynkubaasje mei it Vaccinia Capping Enzyme ferwideret sekundêre struktuer op it 5'ein fan it transkript.Wreidzje tiid út nei 60 minuten foar transkripsjes mei bekende tige strukturearre 5'-einen.
2. RNA brûkt foar capping reaksjes moatte wurde suvere foar gebrûk en suspended yn nuclease-frij wetter.EDTA moat net oanwêzich wêze en de oplossing moat frij wêze fan sâlten.
3. Foar it labeljen fan it 5' ein moat de totale GTP-konsintraasje sawat 1-3 kear de molêre konsintraasje fan mRNA yn 'e reaksje wêze.
4. It folume fan it reaksje systeem kin wurde skalearre op of del neffens de eigentlike.
