EndoFree Plasmid Maxi Kit

Opslach betingsten

RNaseA moat wurde opslein by -30 ~ -15 ℃ en ferfierd by ≤0 ℃.

Endotoxin Scavenger kin wurde opslein by 2 ~ 8 ℃ foar ien moanne, opslein by -30 ~ -15 ℃ foar lange-termyn opslachen ferfierd by ≤0 ℃.

Oare ûnderdielen moatte wurde opslein by keamertemperatuer (15 ~ 25 ℃) en ferfierd by keamertemperatuer.

Components

RNaseA:10 mg / ml, brûkt om RNA te ferwiderjen.

Buffer P1:baktearjele suspension buffer, foegje RNaseA ta oan Buffer P1 foar it earste gebrûk.

Buffer P2:bakteriële lysis buffer (befettet SDS / NaOH).

Buffer P4:neutralizing buffer.

Endotoxine Scavenger:Endotoxine effektyf fuortsmite fan it rûge plasmidekstrakt.

Buffer PW:waskbuffer, foegje it stipulearre folume fan ethanol ta foar it earste gebrûk.

Buffer TB:eluaasje buffer.

FastPure DNA Maxi-kolommen:plasmid DNA adsorpsje kolommen.

Sammelbuizen 50 ml:filtrate kolleksje buizen.

Endotoxine-frije sammelbuis:plasmid DNA kolleksje buizen.

Tariede Materialen

Absolute ethanol, isopropanol, 50 ml rûne boaiem centrifuge buizen en 50 ml endotoxine-frijcentrifuge buizen.

Oanfraach

Dit produkt is geskikt foar grutskalige winning fan plasmiden fan 150 - 300 ml baktearjele oplossingoernachtich kultivearre.

Eksperimint Proses

1. Nim 150 - 200 ml (net mear as 300 ml) fan baktearjele oplossing dy't oernacht wurdt kweekt en sintrifugerje byoer 11.000 rpm (12.000 × g) foar 1 - 2 min.Ferwiderje de supernatant en sammelje baktearjes.

Δ By it sammeljen fan mear dan 50 ml baktearjele oplossing, kinne de baktearjes wurde sammele troch it tafoegjen fan baktearjele oplossing, sintrifugering, it fuortheljen fan de supernatant en oare stappen yn deselde 50 ml buis foar

meardere kearen.

2. Foegje 7,5 ml Buffer P1 ta (kontrolearje asjebleaft oft RNaseA is tafoege oan Buffer P1) oan 'e sintrifugebuis mei baktearjes en mix yngeand troch vortex of pipetting.

Δ De folsleine resuspension fan baktearjes yn dizze stap is kritysk om te leverjen, en d'r moatte gjin baktearjende klonten wêze nei resuspension.As der baktearjele klonten binne dy't net yngeand mingd binne, sil it de lysis beynfloedzje, wat resulteart yn lege opbringst en suverens.As de OD600 fan baktearjele oplossing is 0,65, is it oan te rieden dat 7,5 ml fan Buffer P1 brûkt wurde by it útlûken fan 150 ml fan baktearjele oplossing;doe't OD600 is 0,75, 8 ml fan Buffer P1 moatte brûkt wurde en de folume fan Buffers P2 en P4 moatte wurde feroare neffens.As it folume fan 'e baktearjele oplossing wurdt ferhege nei 200 ml, is it oan te rieden dat defolume fan Buffers P1, P2, en P4 wurde proporsjoneel ferhege.

3. Foegje 7,5 ml Buffer P2 ta oan de baktearjele suspensie fan stap 2 en mingje sêft op en del foar 6 - 8kear en ynkubearje by keamertemperatuer foar 4 - 5 minuten.

Δ Invert foarsichtich om goed te mingjen.Vortexing sil de genomyske DNA-fragmintaasje feroarsaakje, wat resulteart yn genomyske DNA-fragminten yn it ekstrahearre plasmid.Op dit stuit wurdt de oplossing viskeus en trochsichtich, wat toant dat de baktearjes folslein lysearre binne.De doer moat net mear as 5 min wêze om ferneatiging fan 'e plasmiden te foarkommen.As de oplossing net dúdlik is, kinne der tefolle baktearjes resultearjeûnfolsleine lysis, dus it bedrach fan baktearjes moat wurde fermindere passend.

4. Foegje 7,5 ml fan Buffer P4 ta oan 'e baktearjele ophinging fan stap 3 en ynvertearje fuortendaliks 6 - 8 kear om de oplossing folslein te neutralisearjen Buffer P2.Op dit stuit moat wite flocculent delslach ferskine.Centrifugerje by mear dan sawat 11.000 rpm (12.000 × g) foar 10 - 15 min, pipet de supernatant foarsichtich yn in nije 50 ml rûne boaiem sintrifugebuis (sels taret), en foarkommeaspirearje de driuwende wite delslach.

Δ Foegje Buffer P4 ta en keare fuortendaliks om goed te mingjen.Lit de buis stean oant de wite delslach lykwichtich ferdield is yn 'e oplossing om de produksje fan pleatslike delslach te foarkommen dy't de neutralisaasje kin beynfloedzje.As d'r gjin unifoarm wyt flocculent delslach is foar sintrifugering en de supernatant is net dúdlik nei sintrifugering, kin de buis wurdecentrifuged foar in oare 5 min.

5. Add 0. 1 kear it folume (10% fan de supernatant folume, oer 2,2 ml) fan Endotoxin Scavenger oan de supernatant út stap 4 en invert te mix.Plak de oplossing yn in iisbad of ynfoegje yn gemalen iis (of kuolkast) foar 5 min oant de oplossing feroaret fan troebel nei dúdlik en transparant (of noch altyd)wat troebel), en soms ferskate kearen mingje.

Δ Nei't de Endotoxine Scavenger oan 'e supernatant tafoege is, sil de supernatant troebel wurde, mar desupernatant moat dúdlik wurde (of wat troebel) nei it koeljen yn it iisbad.

6. Nei't de supernatant op keamertemperatuer (> 25 ℃) foar 10 - 15 min pleatst is, sil it troebel wurde assyn temperatuer nimt ta nei keamertemperatuer.Dan moat de supernatant omkeard wurde om te mingjen.

Δ As keamertemperatuer leger is of jo de ekstraksjetiid wolle ferminderje, kin de supernatant wurde ynkubeare yn in 37 ~ 42 ℃ wetterbad foar 5 - 10 min en de folgjende stap kin wurde útfierd nei de supernatantwurdt troebel.

7. Centrifugerje de supernatant op sawat 11.000 rpm (12.000 × g) foar 10 min by keamertemperatuer (temperatuer moat> 25 ℃ wêze) om de faze te skieden.De boppeste wetterige faze befettet it DNA, wylst de legere blauwe oaljefaze laach endotoxine en oare ûnreinheden befettet.Oerdrage deDNA-befette aqueous faze nei in nije buis ensmyt de fette laach.

Δ De temperatuer by sintrifugaasje moat boppe 25 ℃ wêze, om't effektive fazeskieding dat net dochtfoarkomme as de temperatuer te leech is.

Δ As de fazeskieding net effektyf is, kin de sintrifugeringtemperatuer oanpast wurde oan 30 ℃ ende tiid fan centrifugation kin wurde ferhege nei 15 min.

Δ Sûgje de blauwe fette laach net, om't it endotoxine en oare ûnreinheden befettet.

Meganisme

Resuspension Lysis Neutralisaasje

◇ Foegje 7,5 ml buffer P1 ta

◇ Foegje 7,5 ml buffer P2 ta

◇ Foegje 7,5 ml buffer P4 ta

Endotoxine fuortheljen

◇ Add 0. 1 kear de supernatant folume fan Endotoxin Scavenger

Bining en Waskje

◇ Foegje 0,5 kear it folume fan isopropanol ta

◇ Foegje 10 ml buffer PW ta