5 × Neoscript Fast RT-qPCR Premix plus-UNG
Cat No: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) is in tige stabile ien-buis probe-basearre miks geskikt foar ien-stap reverse transkripsje en kwantitative PCR (qRT-PCR).It stipet foar-mingen fan primers en probes en bliuwt stabyl nei lange opslach by lege temperatuer.It te testen stekproef kin direkt wurde tafoege by it brûken, sûnder ekstra buis iepening / pipetting operaasje.Dit produkt leveret komponinten, bygelyks hot-start DNA polymerase, M-MLV, waarmtelabile uracil DNA glycosylase (TS-UNG), RNase Inhibitor, MgCl2, dNTP's (mei dUTP ynstee fan dTTP), en stabilisatoren.Mei de genetysk modifisearre rappe amplifikaasje reverse transkriptase en DNA-polymerase is it mooglik om de PCR-amplifikaasje binnen 20-40 minuten te foltôgjen.Dit reagens brûkt spesjale buffer foar qPCR mei mingde enzymen fan anty-inhibitory amplification enzyme en UNG enzyme.Dêrom kin it goede amplifikaasje fan doelgenen krije en falske amplifikaasje foarkomme feroarsake troch PCR-residinsje en aerosolfersmoarging.Dit reagens is kompatibel mei de measte fluorescence kwantitative PCR-ynstruminten fan fabrikanten lykas Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad en Roche.
Komponint
1.25 × Neoscript Fast RTase / UNG Mix
2.5 × Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP)
Storage Betingsten
Alle komponinten moatte wurde bewarre op -20 ℃ foar opslach op lange termyn en 4 ℃ oant 3 moannen.Mix asjebleaft yngeand nei thawing en centrifuge foardat gebrûk.Foarkom faak freeze-thaw.
qRT-PCR Reaction System Tarieding
| Components | 25μLSysteem | 50μLSysteem | Finale konsintraasje |
| 5 × Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP) | 5 μl | 10μL | 1× |
| 25 × Neoscript Fast RTase / UNG Mix | 1 μl | 2 μl | 1× |
| 25 × Primer-Probe Mixa | 1 μl | 2 μl | 1× |
| Template RNAb | - | - | - |
| ddH2O | Oant 25μL | Oant 50 μL | - |
1) a.De definitive konsintraasje fan primer is normaal 0.2μM.Foar bettere resultaten kin de primerkonsintraasje wurde optimalisearre binnen it berik fan 0.2-1μM.Yn 't algemien kin de probekonsintraasje wurde optimalisearre binnen it berik fan 0.1-0.3μM.
2) b. By it brûken fan in flugge PCR Proseduere, it fergrutsjen fan de konsintraasje fan primers en probes kin resultearje yn bettere amplification resultaten, en harren ferhâlding moat wurde optimalisearre neffens.
3) Ferskillende soarten samples befetsje ferskillende soarten en ynhâld fan inhibitor en kopy oantal doelgenen.It sample folume moat wurde beskôge troch werklike tastân.Meitsje in verdunning fan it stekproef mei nukleasefrij wetter of TE Buffer, as nedich.
Reaksje Cbetingsten
| Reguliere PCR-proseduere | Fast PCR Proseduere | ||||||
| Proseduere | Temp. | Tiid | Syklus | Proseduere | Temp. | Tiid | Syklus |
| Omkearde transkripsje | 50 ℃ | 10-20 min | 1 | Omkearde transkripsje | 50 ℃ | 5 mins | 1 |
| Polymerase Aktivearring | 95 ℃ | 1-5 min | 1 | Polymerase Aktivearring | 95 ℃ | 30s | 1 |
| Denaturaasje | 95 ℃ | 10-20s | 40-50 | Denaturaasje | 95 ℃ | 1-3s | 40-50 |
| Annealing en Útbou | 56-64 ℃ | 20-60s | Annealing en Útbou | 56-64 ℃ | 3-20s | ||
Kwaliteitsbeweitsing
1.Funksje opspoaren: gefoelichheid, spesifisiteit en repeatability fan qPCR.
2.Gjin eksogene nukleaseaktiviteit: gjin eksogene endonuklease en exonuklease fersmoarging.
Notysjes
1.Amplifikaasjesnelheid fan rappe DNA-polymerase is net minder dan 1kb/10s.Ferskillende PCR-ynstruminten hawwe ferskillende ferwaarmings- en kuolsnelheden, temperatuerkontrôlemodi en termyske konduktiviteit, en dus is optimisaasje fan jo primer / probe-konsintraasje en rinnende metoade yn kombinaasje mei jo spesifike snelle PCR-ynstrumint essensjeel.
2.Dit produkt docht brede tapasberens, en it is geskikt foar hege gefoelichheid molekulêre diagnoaze.Trije-stap PCR metoade wurdt oanrikkemandearre foar primers mei lege annealing temperatuer of foar amplification fan lange fragminten oer 200 bp.
3.Sûnt ferskate amplicons hawwe ferskillende benutten effisjinsje fan dUTP en ferskillende gefoelichheid foar UNG, de reagents moatte wurde optimalisearre as de deteksje gefoelichheid ôfnimt by it brûken fan UNG systeem.Nim dan kontakt mei ús op foar technyske stipe as nedich.
4.Om amplifikaasje fan oerdracht PCR-produkten te foarkommen, binne tawijd eksperiminteel gebiet en pipet nedich foar amplifikaasje.Operearje mei wanten en feroarje faak en iepenje de PCR-buis net nei amplifikaasje.
