M-MLV reverse transkriptase
RevScript Reverse transkriptase wurdt krigen troch genetyske technyk.It hat hegere cDNA-syntezefermogen, thermyske stabiliteit en limyt fan reaksjetemperatuer (oant 60 ° C).It synthesized cDNA-produkt is oant 10 kb.It fersterket de affiniteit fan 'e sjabloanen en is geskikt foar omkearde transkripsje fan RNA-sjabloanen mei komplekse sekundêre struktuer of genen mei lege kopy.
Components
| Komponint | HC2003B (10.000 U) | HC2003B (5*10.000U) | HC2003B (200.000 U) |
| RevScript Reverse Transcriptase (200U/μL) | 50 μL | 5×50 μL | 1 ml |
| 5 × RevScript-buffer | 250 μL | 1,25 ml | 5 ml |
Storage Condition
Dit produkt moat wurde opslein by -25 ° C ~ -15 ° C foar 2 jier.
Unit Definition
Ien ienheid omfettet 1 nmol dTTP yn soer-ûnoplosber materiaal yn 10 minuten by 37 ° C mei Oligo (dT) as primers.
Reaksje Setup
1.Denaturaasje fan RNA-sjabloan (Dizze stap is opsjoneel, denaturaasje fan RNA-sjabloan helpt om de sekundêre struktueren te iepenjen, wat de opbringst fan 'e earste strân cDNA sil ferbetterje.)
| Components | Volume (μL) |
| RNase frije ddH2O | Oan 13 |
| Oligo (dT)18 (50 μmol/L) of Random Primer (50 μmol/L) Of gene-spesifike primers (2 μmol/L) | 1 |
| of 1 | |
| of 1 | |
| RNA sjabloan | X a |
Notysjes:
1) a: Totaal RNA: 1-5 ug of mRNA: 1-500 ng
2) Incubating by 65 ° C foar 5 minuten, dan oerdrage op iis fuortendaliks nei chill foar 2 minuten.Koarte sintrifugering om reaksjefloeistof te sammeljen, foegje de oplossing foar omkearde transkripsjereaksje ta lykas werjûn yn 'e folgjende tabel.Pipetteer sêft om te mingjen.
1.Tarieding fan it reaksjegemik (20 μL folume)
| Components | Volume (μL) |
| Mingsel fan foarige stap | 13 |
| 5 × Buffer | 4 |
| dNTP Mix (10nmol/L) | 1 |
| Omkearde transkriptase (200 U/μL) | 1 |
| RNase-ynhibitor (40 U/μL) | 1 |
1.Utfiere de reaksje ûnder de folgjende betingsten:
| Temperatuer (°C) | Tiid |
| 25 °Ca | 5 mins |
| 42 °Cb | 15-30 min |
| 85 °Cc | 5 mins |
Notysjes:
1) a.Inkubearje by 25 ° C foar 5 minuten is allinich nedich foar it brûken fan willekeurige hexamers.Sla asjebleaft dizze stap oer by it brûken fan Oligo (dT)18of Gene spesifike Primer.
2) b.De rekommandearre omkearde transkripsjetemperatuer is 42 ° C, Foar sjabloanen mei yngewikkelde sekundêre struktueren of hege GC-ynhâld is it oan te rieden om de reaksjetemperatuer te ferheegjen nei 50-55 ° C.
3) c.Ferwaarming op 85 ° C foar 5 minuten om reverse transkriptase te ynaktivearjen.
4) It produkt kin direkt brûkt wurde yn PCR- of qPCR-reaksjes, of opslein by -20 ° C foar koarte termyn opslach.It is oan te rieden om de produkten te alignearjen en op te slaan by -80 ° C foar opslach op lange termyn.Foarkom faak freeze-thaw.
5) It produkt is geskikt foar ien-stap RT-qPCR, it is oan te rieden om 10-20 U reverse transkriptase ta te foegjen foar elke 25μL reaksje systeem, of stadichoan fergrutsje it bedrach fan reverse transkriptase neffens de eigentlike situaasje.
Notysjes
1.Hâld asjebleaft it eksperiminteel gebiet skjin;Under operaasje moatte skjinne wanten en maskers droegen wurde.Alle verbruiksartikelen brûkt yn it eksperimint moatte RNase-frij wêze om RNase-fersmoarging te foarkommen.
2.Alle prosedueres moatte wurde útfierd op iis om RNA-degradaasje te foarkommen.
3.RNA-samples fan hege kwaliteit wurde oanrikkemandearre om hege effisjinsje fan omkearde transkripsje te garandearjen.
4.Dit produkt is allinich foar ûndersyksgebrûk.
5.Operearje asjebleaft mei labjassen en wegwerphandschoenen, foar jo feiligens.
