RTL Reverse Transcriptase
RTL reverse transkriptase is in RNA-sjabloan-ôfhinklike DNA-polymerase dy't de 3'→5'-exonuklease-aktiviteit mist en RNase H-aktiviteit hat.Dit enzyme kin RNA brûke as sjabloan om in komplemintêre DNA-streng te synthesisearjen, dat kin wurde tapast op earste-string cDNA-synteze, foaral foar RT-LAMP (loop-mediated isothermal amplification).Yn ferliking mei RTL reverse transkriptase 1.0 is de gefoelichheid signifikant ferbettere, de thermyske stabiliteit is sterker, en de reaksje op 65 ° C is stabiler.RTL reverse transkriptase (glycerolfrij) kin brûkt wurde om gevriesdroogde preparaten, gevriesdroogde RT-LAMP-reagenzjes, ensfh.
Unit Definition
Ien ienheid omfettet 1 nmol dTTP yn soer-presipitabel materiaal yn 20 minuten by 50 ° C mei poly(A)•oligo(dT)25 as template-primer.
Components
| Komponint | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL reverse transkriptase (glycerolfrij) (15U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10 × HC RTL Buffer | 1,5 ml | 4×1,5 ml | 5×10 ml |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 ml | 2×1,5 ml | 3×10 ml |
Storage Condition
Ferfier ûnder 0 ° C en wurde opslein by -25 ° C ~ -15 ° C.
Kwaliteitsbeweitsing
- Residuele aktiviteit fanEndonuklease:In 50 μL reaksje mei 1 μg fan λDNA en 15 ienheden fan RTL2.0 ynkubearre foar 16 oeren by 37 ℃ lit itselde patroan sjen as negative kontrôle troch gelelektroforese.
- Residuele aktiviteit fanExonuclease:In 50 μL reaksje mei 1 μg Hind Ⅲ digested λDNA en 15 ienheden fan RTL2.0 ynkubearre foar 16 oeren by 37 ℃ lit itselde patroan sjen as negative kontrôle troch gelelektroforese.
- Residuele aktiviteit fanNickase:In 50 μL reaksje mei 1 μg fan supercoiled pBR322 en 15 ienheden fan RTL2.0 ynkubearre foar 4 oeren by 37 ° C lit itselde patroan sjen as negative kontrôle troch gelelektroforese.
- Residuele aktiviteit fanRNase:In reaksje fan 10 μL mei 0.48 μg MS2 RNA en 15 ienheden fan RTL2.0 ynkubearre foar 4 oeren by 37 ° C lit itselde patroan sjen as negative kontrôle troch gelelektroforese.
- E. coli gDNA:Metten meiE.colispesifike HCD-deteksjekits, 15 ienheden fan RTL2.0 befettet minder dan 1E. coligenom.
Reaksje Setup
cDNA Synthesis Protocol
| Components | Folume |
| Template RNA a | fakultatyf |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) of Random Primer-mix (60uM) | 2 μl |
| dNTP Mix (10mM elk) | 1 μl |
| RNase-ynhibitor (40U/uL) | 0,5 μL |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/uL) | 0,5 μL |
| 10 × HC RTL Buffer | 2 μl |
| Nuclease-frij wetter | Oant 20 μL |
Notysjes:
1) De oanrikkemandearre dosaasje fan Totaal RNA is 1ng ~ 1μg
2) De oanrikkemandearre dosaasje fan mRNA wie 50ng ~ 100ng
Thermo-cycling Betingsten foar in routine reaksje:
| Temperatuer (°C) | Tiid |
| 25 °Ca | 5 mins |
| 55 °C | 10 minb |
| 80 °C | 10 min |
Notysjes:
1) As Random Primer Mix wurdt brûkt, in inkubaasjestap by 25 °C.
2) As doelprimermix wurdt brûkt, in inkubaasjestap by 55 ° C foar 10 ~ 30 minuten.
RT-LAMP Protokol
| Components | Folume | Finale konsintraasje |
| Template RNA | fakultatyf | ≥ 10 eksimplaren |
| dNTP Mix (10mM) | 3,5 μL | 1,4 mM |
| FIP/BIP Primers (25×) | 1 μl | 1,6 μM |
| F3/B3 Primers (25×) | 1 μl | 0,2 μM |
| LoopF/LoopB Primers (25×) | 1 μl | 0,4 μM |
| RNase-ynhibitor (40U/μL) | 0,5 μL | 20 U / reaksje |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/μL) | 0,5 μL | 7,5 U / reaksje |
| Bst V2 DNA Polymerase (8U/μL) | 1 μl | 8 U / reaksje |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 μL | 6 mM (totaal 8 mM) |
| 10 × HC RTL-buffer (of 10 × HC Bst V2-buffer) | 2,5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| Nuclease-frij wetter | Oant 25 μL | - |
Notysjes:
1) Mix troch vortexing en sintrifuge koart om te sammeljen.Konstante temperatuer ynkubaasje by 65 ° C foar 1 oere.
2) De twa buffers binne ynteroperabel en hawwe deselde gearstalling.
Notysjes
1.Dit produkt sil in wyt fêst foarmje as opslein by -20 °C.Nim it út fan -20 ° C en set it op iis foar sa'n 10 minuten.Nei it smelten kin it brûkt wurde troch te skodzjen en te mingjen.
2.It cDNA-produkt koe wurde opslein by -20 ° C of -80 ° C of fuortendaliks brûkt foar PCR-reaksje.
3.Om RNase-kontaminaasje te foarkommen, hâld it eksperiminteel gebiet skjin, en drage skjinne wanten en maskers by operaasje.
