M-MLV Neoscript Reverse Transcriptase
Neoscript Reverse Transcriptase is in omkearde transkriptase krigen troch mutaasje-screening fan it M-MLV-gen fan Moloney murine leukemy-firus oarsprong en ekspresje yn E.coli.It enzyme ferwideret RNase H-aktiviteit, hat hegere temperatuertolerânsje, en is geskikt foar reverse transkripsje op hege temperatuer.Dêrom is it nuttich foar it eliminearjen fan 'e ûngeunstige effekten fan' e RNA-struktuer op hege nivo en net-spesifike faktoaren op cDNA-synteze, en hat hegere stabiliteit en omkearde transkripsjesynthesefermogen.It enzyme hat hegere stabiliteit en reverse transkripsjesynthesefermogen.
Components
1.200 U/μL Neoscript Reverse Transcriptase
2.5 × earste-string buffer (opsjoneel)
* 5 × First-Strand Buffer befettet gjin dNTP, foegje asjebleaft dNTP's ta by it tarieden fan it reaksjesysteem
Oanrikkemandearre applikaasje
1.Ien-stap qRT-PCR.
2.RNA-firusdeteksje.
Storage Condition
-20 ° C foar lange termyn opslach, moat goed mingd wurde foar gebrûk, foarkomme faak frieze-ûndooi.
Unit Definition
Ien ienheid befettet 1 nmol dTTP yn 10 minuten by 37 ° C mei poly(A)•oligo(dT)25as sjabloan / primer.
Kwaliteitsbeweitsing
1.SDS-PAGE elektroforetyske suverens grutter dan 98%.
2.Amplification gefoelichheid, batch-to-batch kontrôle, stabiliteit.
3.Gjin eksogene nuclease-aktiviteit, gjin eksogene endonuclease of exonuclease-fersmoarging
Reaksje-opset foar oplossing foar earste kettingreaksje
1.Tarieding fan it reaksje mingsel
| Components | Folume |
| Oligo (dT)12-18 Primer of Random Primerin Of gene spesifike primersb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μl |
| Template RNA | Totaal RNA≤ 5μg;mRNA≤ 1 μg |
| RNase-frije dH2O | oant 10 μL |
Notysjes:a / b: Selektearje asjebleaft ferskate soarten primers neffens jo eksperimintele behoeften.
2.Ferwaarmje op 65 ° C foar 5 minuten en koelje fluch op iis foar 2 minuten.
3.Foegje de folgjende komponinten ta oan it boppesteande systeem ta in totale folume fan 20µL en mingje foarsichtich:
| Components | Volume (μL) |
| 5 × earste-string buffer | 4 |
| Neoscript Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 1 |
| RNase-ynhibitor (40 U/μL) | 1 |
| RNase-frije dH2O | Oant 20 μL |
4.Please útfiere de reaksje neffens de folgjende betingsten:
(1) As Random Primer wurdt brûkt, moat de reaksje wurde útfierd op 25 ℃ foar 10mins, en dan by 50 ℃ foar 30 ~ 60mins;
(2) As Oligo dT of spesifike primers wurde brûkt, moat de reaksje wurde útfierd by 50 ℃ foar 30 ~ 60 minuten.
5.Ferwaarmje op 95 ℃ foar 5 minuten om Neoscript Reverse Transcriptase te ynaktivearjen en de reaksje te beëinigjen.
6.Omkearde transkripsjeprodukten kinne direkt brûkt wurde yn PCR-reaksje en fluorescinsje kwantitative PCR-reaksje, of opslein by -20 ℃ foar in lange tiid.
PCR Raksje:
1.Tarieding fan it reaksje mingsel
| Components | Konsintraasje |
| 10 × PCR-buffer (dNTP fergees, Mg²+ fergees) | 1× |
| dNTP's (10mM elk dNTP) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq DNA Polymerase (5U/μL) | 2-2.5 U |
| Primer 1 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Primer 2 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Sjabloanin | ≤10% oplossing foar earste kettingreaksje (2 μL) |
| ddH2O | Oant 50 μL |
Notysjes:a: As tefolle earste kettingreaksje oplossing wurdt tafoege, kin de PCR-reaksje ynhibeare wurde.
2.PCR-reaksjeproseduere
| Stap | Temperatuer | Tiid | Cycles |
| Pre-denaturaasje | 95 ℃ | 2-5 min | 1 |
| Denaturaasje | 95 ℃ | 10-20 sek | 30-40 |
| Annealing | 50-60 ℃ | 10-30 sek | |
| Útbou | 72℃ | 10-60 sek |
Notysjes
1.Geskikt foar optimisaasje fan omkearde transkripsjetemperatuer yn it berik fan 42 ℃ ~ 55 ℃.
2.It hat bettere stabiliteit, is geskikt foar hege temperatuer reverse transkripsje amplification.Derneist is it geunstich foar it effisjint trochjaan fan komplekse strukturele regio's fan RNA.Ek, itis geskikt foar ien-stap multiplex fluorescence kwantitative RT-PCR-deteksje.
3.Goede kompatibiliteit mei ferskate PCR-amplifikaasje-enzymen en is geskikt foar RT-PCR-reaksjes mei hege gefoelichheid.
4.Geskikt foar hege gefoelichheid ien-stap fluorescence kwantitative RT-PCR reaksje, effektyf ferbetterjen de opspoaren taryf fan lege konsintraasje fan sjabloanen.
5.Geskikt foar cDNA-biblioteekbou.
