Uracil DNA Glycosylase
Uracil-DNA Glycosylase (UNG of UDG) is in rekombinante kloon fan E.coli mei in molekulêre gewicht fan 25 kDa.It katalysearret de frijlitting fan frije uracil út uracil-befette single-strâne en dûbele-strâne DNA, en is ynaktyf tsjin RNA, en kin brûkt wurde om foar te kommen kontaminaasje fan PCR amplification produkten.It prinsipe fan aksje is basearre op it feit dat as dUTP wurdt ferfongen troch dTTP yn 'e PCR-reaksje en in PCR-amplifikaasjeprodukt wurdt foarme mei dU-basen, it enzyme kin selektyf de glycoside-bân fan U-basen brekke yn single-stranded en double-stranded DNA en degradearje it PCR-amplifikaasjeprodukt.
Oanrikkemandearre applikaasje
Kontaminaasje Previnsje Amplification
Storage Condition
-20 ° C foar lange termyn opslach, moat goed mingd wurde foar gebrûk, foarkomme faak frieze-ûndooi.
Opslach buffer
20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, Stabilisator, 50% Glycerol.
Unit Definition
De hoemannichte enzyme dy't nedich is om 1µg ienstrengige DNA te degradearjen mei dU-basen yn 1 oere by 37 ° C is 1 ienheid.
Kwaliteitsbeweitsing
1.SDS-PAGE elektroforetyske suverens grutter dan 98%
2.Amplification gefoelichheid, batch-to-batch kontrôle, stabiliteit
3.Nei't 1U fan UNG 2 minuten op 50 ℃ is behannele, moat it sjabloan mei U ûnder 103 eksimplaren folslein degradearre wurde en kin gjin amplifikaasjeprodukt wurde produsearre
4.Gjin eksogene nuclease-aktiviteit
Ynstruksjes
| Components | Volume (μL) | Finale konsintraasje |
| 10 × PCR-buffer (dNTP fergees, Mg²+frij) | 5 | 1× |
| dUTPs (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (ferfange dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0.25 | 1.25 U |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × Primer Mixin | 2 | 1× |
| Sjabloan | - | ＜1μg/reaksje |
| ddH₂O | Oan 50 | - |
Noat: a: As brûkt foar qPCR / qRT-PCR, moat de fluorescent probe yn it reaksjesysteem tafoege wurde.Gewoanlik kin in definitive primerkonsintraasje fan 0,2 μM goede resultaten jaan;as de reaksje prestaasjes min is, kin de primerkonsintraasje yn it berik fan 0,2-1 μM oanpast wurde.Gewoanlik wurdt de probekonsintraasje optimalisearre yn it berik fan 0,1-0,3 μM.Konsintraasjegradienteksperiminten kinne wurde útfierd om de bêste kombinaasje fan primer en sonde te finen.
Notysjes
1.UNG-enzyme kin brûkt wurde om de fersmoarge dUTP-amplifikaasjeprodukten út it reaksjesysteem te ferwiderjen foardat de PCR-amplifikaasjereaksje, dan om falsk-positive resultaten te foarkommen fanwege produktfersmoarging.
2.De optimale temperatuer foar UNG-enzyme om te brûken yn 'e anty-kontaminaasje PCR-reaksje is oer it generaal 50 ℃ foar 2mins;de ynaktivearring betingst is 95 ℃ foar 5mins.
3.Foarkom faak befrieze-tooi, en bleatstelle net oan grutte temperatuerfluktuaasjes.
4.Ferskillende genen dy't moatte wurde fersterke hawwe ferskillende benutten effisjinsje fan dUTP en gefoelichheid foar UNG enzyme, dêrom, as it brûken fan UNG systeem liedt ta in fermindering fan deteksje gefoelichheid, it reaksje systeem moat wurde oanpast en optimalisearre, as jo nedich technyske stipe, nim dan kontakt op mei ús bedriuw.
