2 × Sensi Direct Premix-UNG (Probe qPCR)
Cat No: HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) is ûntworpen om PCR direkt út te fieren fan samples sûnder DNA-ekstraksje of sample-tarieding.Dit reagens bestiet út hot-start DNA polymerase, uracil DNA glycosylase (UNG), RNase Inhibitor, MgCl2, dNTP's (mei dUTP ynstee fan dTTP), en stabilisatoren, foar kwantitative PCR (qPCR).Dit reagens foarmet in hege ynhibitor-tolerânsje, en dus kin it direkt wurde tapast op de detectie fan samples lykas keelswab, speeksel, anty-koagulearre folslein bloed, plasma en serum sûnder DNA-ekstraksje.It reagens brûkt proprietêre buffer foar qPCR mei mingde enzymen fan anty-inhibitoryske DNA-polymerase en UNG-enzyme.Dêrom kin it in goede amplifikaasje krije fan doelgenen yn samples dy't ynhibitoren befetsje en falske positive amplifikaasje remme feroarsake troch PCR-residu- en aerosolfersmoarging.Dit reagens is kompatibel mei de measte fluorescent kwantitative PCR-ynstruminten, lykas Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche ensafuorthinne.
Components
1. 50 × SensiDirect Enzyme / UNG Mix
2. 2 × SensiDirect Premix Buffer (dUTP)
Opslach betingsten
Alle komponinten moatte wurde bewarre op -20 ℃ foar opslach op lange termyn en 4 ℃ oant 3 moannen.Mix asjebleaft yngeand nei thawing en centrifuge foardat gebrûk.Foarkom faak freeze-thaw.
Cycling Protokol
| Stap | Temperatuer | Tiid | Syklus |
| Digestion | 50 ℃ | 2 min | 1 |
| Aktivearring fan polymerase | 95 ℃ | 1-5 min | 1 |
| Denature | 95 ℃ | 10-20s | 40-50 |
| Annealing / Extension | 56-64 ℃ | 20-60s |
Pipetting Ynstruksjes
| Reagens | Volume per reaksje | Folume per reaksje | Finale konsintraasje |
| 2 × SensiDirect Premix Buffer (dUTP) | 12,5 µL | 25 µl | 1× |
| 50 × SensiDirect Enzyme / UNG Mix | 0,5 µL | 1 µl | 1× |
| 25 × Primer-Probe Mix1, 2 | 1 µl | 2 µl | 1× |
| Foarbyld3, 4 | - | - | - |
| ddH2O | - | - | - |
| Totale folume | 25 μL | 50 μL | - |
1. De definitive konsintraasje fan primer is meastentiids 0.2μM.Foar bettere resultaten kin de primerkonsintraasje wurde optimalisearre binnen it berik fan 0.2-1μM.
2. Algemien kin de probe-konsintraasje optimisearre wurde binnen it berik fan 0.1-0.3μM.De optimale konsintraasje fan 'e sonde is relatearre oan it real-time PCR-amplifikaasjeynstrumint, it type sonde, en it type fluorescent labelingsubstân.Sjoch asjebleaft nei it ynstruminthantlieding as de spesifike easken fan elke fluorescent sonde.
3. Ferskillende soarten samples befetsje ferskillende soarten en ynhâld fan inhibitor en kopiearje oantal doelgenen.It sample folume moat wurde beskôge troch werklike tastân.Meitsje in verdunning fan it stekproef troch it tafoegjen fan nukleasefrij wetter as TE Buffer, as nedich.
4. Oanrikkemandearre folume fan ferskate samples:
| Foarbyld | Volume foar ien 50 μL reaksje | Maksimum ferhâlding |
| Anticoagulated folslein bloed | 2,5 μL | 5% |
| Plasma | 15 μL | 30% |
| Serum | 10 μL | 20% |
| Keel swab | 10 μL | 20% |
| Speeksel | 10 μL | 20% |
Kwaliteitsbeweitsing
1. Funksje opspoaren: gefoelichheid, spesifisiteit en repeatability fan qPCR.
2. Gjin exogenous nuclease aktiviteit: gjin exogenous endonuclease en exonuclease fersmoarging.
Notysjes fan Produkt
1. Dit produkt brûkt in nij type hot-start DNA polymerase, dat kin wurde aktivearre yn 1-5 minutes.Since syn reaksje buffer is optimalisearre, it is mear geskikt foar dûbele of meardere fluorescence kwantitative PCR brûkend probe metoade.
2. As de Rn-wearde fan 'e PCR-amplifikaasje te leech is of de amplifikaasje is fansels ynhibeare, kin it ferminderjen fan it samplebedrach, ferheegjen fan reaksjevolumint of eardere ferwidering fan' e stekproef de resultaten ferbetterje.
3. De kolleksje fan bloed, speeksel, urine, keel swab, ensfh moat folgje de klinyske kritearia easken, en farske stekproef kin brûkt wurde om foar te kommen nucleic acid degradaasje.
4. Sûnt ferskillende amplicons hawwe ferskillende benutten effisjinsje nei dUTP en gefoelichheid foar UNG, de reagents moatte wurde optimalisearre as de detection gefoelichheid ôfnimt by it brûken fan UNG systeem.Nim dan kontakt mei ús op foar technyske stipe as nedich.
5. Om amplifikaasje fan oerdracht PCR-produkten tusken ien-stap-reaksjes te foarkommen, binne tawijd eksperiminteel gebiet en pipette nedich foar amplifikaasje.Operearje mei wanten en feroarje faak en iepenje de reaksjebuis net nei PCR-amplifikaasje.
