Plant direkte PCR Kit
Cat No: HCR2020A
Plant Direct PCR Kit is geskikt foar direkte amplification fan plant blêden, sieden, ensfh, en kin brûkt wurde foar hege-throughput screening fan plant monsters dy't net befetsje polysaccharides en polyphenols.De direkte amplifikaasje DNA-polymerase basearre op 'e rjochte evolúsje hat superieure tolerânsje foar PCR-ynhibitoren yn planten.Underwilens behâldt it de hege amplifikaasjeprestaasjes, dy't geskikt is foar de amplifikaasje fan DNA-fragminten binnen 5 kb.De unike Lysis-buffer A yn 'e kit kin brûkt wurde om farske of beferzen plantweefsels te lysearjen.It is maklik te betsjinjen en it lysate kin brûkt wurde as sjabloan foar amplifikaasje sûnder suvering.It systeem befettet beskermjende aginten dy't it mooglik meitsje om rûge samples effektyf te fersterkjen nei werhelle befriezing en ûntdooijen.2 × Plant Direct Master Mix hoecht allinich primers en sjabloanen ta te foegjen om amplifikaasjereaksje út te fieren, dêrmei pipetting operaasjes te ferminderjen en deteksje trochput en reprodusearberens fan resultaten te ferbetterjen.
Components
| Components | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × Plant Direct Master Mix | 1,25 ml | 4×1,25 ml |
| Plant Direct Lysis Buffer A | 5 ml | 20 ml |
| Plant Direkte Lysis Buffer B* | 5 ml | 20 ml |
* Plant Direct Lysis Buffer B is in opsjoneel reagens, dat wurdt brûkt om Plant Direct Lysis Buffer A te neutralisearjen foar it ferlingjen fan de opslachtiid fan samples.It kin brûkt wurde neffens de werklike situaasje.
Storage Betingsten
2 × Plant Direct Master Mix, opslaan by -30 ~ -15 ℃ en foarkomme werhelle freezing en thawing;Plant direkte lysisbuffer, bewarje by -30 ~ -15 ℃ of 2 ~ 8 ℃.
Eksperimint Proses
Sample Processing-Plant Leaf
Direkte metoade:It is oan te rieden om jonge blêden te brûken.Brûk in gatpunch mei in fêste diameter fan 0,5 - 3 mm om in lyts en unifoarm samplea te krijen, en foegje dan it probleem direkt ta oan it PCR-systeem (50 μl systeem wurdt oanrikkemandearre).Tink derom, soargje derfoar dat it probleem yn 'e PCR-oplossing is en net tsjin' e buismuorre.As direkte PCR wurdt brûkt om lange fragminten en komplekse samples te fersterkjen, kin it brûken fan in stekproef mei in lytsere diameter (0,5 - 1 mm) as sjabloan helpe om bettere resultaten te krijen.
Slijplysismetoade:It is oan te rieden om jonge blêden te brûken.Nim in lyts stikje blêd (sawat 1 - 3 mm yn diameter), pleats it yn 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab, en grind it safolle mooglik (dizze stap kin dien wurde troch it blêd te knipjen mei in 100 μl pipette tip om it monster te mash).As gruttere folumes fan blêdweefsel wurde brûkt (net mear as 7 mm), ferheegje it folume fan verdunningsbuffer nei 50 μl.Nei't de blêden grûn binne, moat de oplossing grien ferskine.Nei in koarte sintrifugering, foegje 1 μl fan 'e supernatant ta oan it PCR-systeem as in reaksjesjabloan.
Thermyske lysis metoade:It is oan te rieden om jonge blêden te brûken.Nim in lyts stikje blêd (sawat 1 - 3 mm yn diameter), pleats it yn 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A, en ferwaarmje it op 95 ° C foar 5 - 10 min.De lysistiid kin passend ferlingd wurde foar blêden dy't dreech te lysearjen binne (net mear as 20 min).As gruttere folumes fan blêdweefsel wurde brûkt (net mear as 7 mm), ferheegje it folume fan verdunningsbuffer nei 50 μl.Nei ferwaarming, sintrifuge koart, en foegje 1 μl supernatant ta oan it PCR-systeem as in reaksjesjabloan.
Sample Processing- Plant Seed
Slijplysismetoade:Brûk in skalpel om sieden te snijen mei in diameter fan 5 mm, foegje se ta oan 100 μl fan Plant Direct Lysis Buffer A, en grind it probleem mei in pipet tip of oare ark.Vortex koart en lit stean by keamertemperatuer foar 3 - 5 min.Soargje derfoar dat it siedmonster is ûnderdompele yn 'e verdunningsbuffer.Nei in koarte sintrifugering, foegje 1 μl fan 'e supernatant ta oan it PCR-systeem as in reaksjesjabloan.
Thermyske lysis metoade:Brûk in skalpel om sieden te snijen mei in diameter fan 5 mm, foegje se ta oan 100 μl fan Plant Direct Lysis Buffer A, en waarmje op 95 ° C foar 5 - 10 min.De lysistiid kin passend ferlingd wurde foar blêden dy't dreech te lysearjen binne (net mear as 30 min).Nei ferwaarming, sintrifuge koart, en foegje 1 μl supernatant ta oan it PCR-systeem as in reaksjesjabloan.
in.Skar of oare ark kinne ek brûkt wurde om samples fan gaadlike grutte te snijen;as de punch of skjirre wurde opnij brûkt, se moatte wurde skjinmakke mei 2% natrium hypochlorite oplossing foar elk gebrûk om foar te kommen cross-contamination tusken samples.
b.Soargje derfoar dat de Plant Direct Lysis Buffer folslein smelt is foar gebrûk.As de buffer viskeus is of precipitaten hat, kin it wurde ferwaarme op 37 ℃ om it foar gebrûk folslein te smelten.
c.It folume fan sjabloan yn de reaksje systeem kin oanpast wurde passend neffens it ferskil yn it folume fan plant materiaal en diluent tafoege.
Plant Direkte Lysis Buffer
De Plant Direct Lysis Buffer A befette yn dit produkt is strikt optimalisearre om it genoom fan de measte plantweefsels frij te litten en is geskikt foar koarte termyn opslach fan rûge planten by 4 ℃.As it probleem foar in langere perioade opslein wurde moat (bygelyks 1 - 2 moannen), wurdt it oanrikkemandearre om de supernatant oer te bringen nei in nije EP-buis en op te slaan by -20 ℃.Om de samples stabiler op te slaan, foegje in lykweardich folume fan Plant Direct Lysis Buffer B ta oan de oerdroegen supernatant, mingje goed en bewarje by -20 ℃.De stabile opslachtiid ferskilt mei plantmonsters en steaten.
Reaksje Systeem
| ddH2O | oant 20,0 µl | oant 50,0 µl |
| 2 × Plant Direct Master Mixa | 10,0 µl | 25,0 µ |
| Primer 1 (10 µM) | 0,8 µl | 2,0 µl |
| Primer 2 (10 µM)b | 0,8 µl | 2,0 µl |
| Foarbyld fan plantblêd / rude extract(ferwize nei Sample Processing) | 0,5 – 3 mm blêdskiif/x µl | 0,5 – 3 mm blêdskiif/x µl |
in.It befettet Mg2+by in definitive konsintraasje fan 2 mM.
b.It is oan te rieden om in definitive konsintraasje fan 0.4μM te brûken foar elke primer.Oermjittich gebrûk fan primers sil liede ta ferhege net-spesifike amplifikaasje.
c.It bedrach fan brûkte stekproef kin oanpast wurde neffens de eigentlike situaasje.It bedrach dat brûkt wurdt yn in inkele reaksje fan rau lysed monster kin oanpast wurde tusken 2% - 20% fan it totale folume fan 'e reaksje.It brûken fan tefolle samples kin fersterkjen mislearring feroarsaakje.
Reaksje Program
| Stappen | Temperatuer | Tiid |
| Inisjele denaturaasje | 98℃ | 5 min |
| Denaturaasje | 95 ℃ | 10 sek |
| Annealing | 58 ~ 72 ℃ | 15 sek |
| Útbou | 72℃ | 30 sek |
| Finale útwreiding | 72℃ | 5 min |
in.Inisjele denaturaasje (98 ℃, 5 min) befoarderet lysis fan plantweefsel, it frijlitten fan genomysk DNA dat kin wurde brûkt foar PCR-amplifikaasje.Ferkoart de tiid net of ferleegje de temperatuer.
b.It is oan te rieden om it gelyk te setten oan de primer Tm wearde of 2 ~ 4 ℃ heger as de Tm wearde.De direkte amplification DNA polymerase brûkt yn dit produkt is oars as konvinsjonele Taq DNA polymerase, en hat spesjale easken foar de reaksje annealing temperatuer; it brûken fan hege annealing temperatuer kin effektyf ferminderjen nonspecific amplification en ferbetterjen de amplification effisjinsje.Foar komplekse sjabloanen kin de effisjinte amplifikaasje berikt wurde troch it oanpassen fan annealingtemperatuer en it ferlingjen fan útwreidingstiid.
c.As de lingte fan it amplifikaasjeprodukt ≤1 kb is, wurdt de útwreidingstiid ynsteld op 30 sek/kb;as de lingte fan it amplification produkt is> 1 kb, de útwreiding tiid wurdt ynsteld op 60 sek / kb.
d.Foar komplekse samples as samples mei lege amplifikaasjeopbringst kin it oantal syklusen passend wurde ferhege nei 40 -50 syklusen.
Oanfraach
It is fan tapassing foar direkte amplifikaasje fan plantweefsels en screening mei hege trochset fan plantmonsters dy't gjin polysaccharides en polyfenolen befetsje.
Notysjes
Allinich foar ûndersyksgebrûk.Net foar gebrûk yn diagnostyske prosedueres.
1. Foar rûge plantfersterking of direkte amplifikaasje is it oan te rieden om suvere genomyske DNA te brûken as in positive kontrôle foardat it eksperimint begjint om te soargjen dat it systeem, primers en operaasjes korrekt binne.
2. De direkte amplification DNA polymerase brûkt yn dizze kit hat sterke proofreading aktiviteit.As TA-kloning moat wurde útfierd, wurdt it oanrikkemandearre om it DNA te suverjen foardat it adenine tafoege wurdt.
3. Primer ûntwerpbegelieding:
in.It wurdt oanrikkemandearre dat de lêste basis oan it 3'-ein fan 'e primer G of C wêze moat.
b.Opfolgjende mismatches moatte foarkommen wurde yn 'e lêste 8 bases oan' e 3 'ein fan' e primer.c.Mije haarspjeldstruktueren oan 'e 3' ein fan' e primer.
d.Ferskillen yn 'e Tm-wearde fan' e foarút primer en de reverse primer moatte net mear wêze as 1 ℃ en de Tm-wearde moat oanpast wurde oan 60 ~ 72 ℃ (Primer Premier 5 wurdt oanrikkemandearre om de Tm-wearde te berekkenjen).
e.Ekstra ekstra primer sekwinsjes dy't net oerienkomt mei it sjabloan, moatte net opnommen wurde by it berekkenjen fan de primer Tm wearde.
f.It wurdt oanrikkemandearre dat de GC-ynhâld fan 'e primer 40% -60% is.
g.De totale ferdieling fan A, G, C en T yn 'e primer moat sa even mooglik wêze.Mije gebrûk fan regio's mei hege GC- as AT-ynhâld.
h.Foarkom de oanwêzigens fan komplemintêre sekwinsjes fan 5 of mear basen binnen de primer of tusken twa primers en foarkom de oanwêzigens fan komplementêre sekwinsjes fan 3 of mear basen oan it 3'-ein fan twa primers.
ik.Brûk de NCBI BLAST-funksje om de spesifisiteit fan 'e primer te kontrolearjen om net-spesifike amplifikaasje te foarkommen.
