Proteinase K mNGS (floeiber)
Proteinase K is in stabile serineprotease mei brede substraatspesifisiteit.It degradearret in protte aaiwiten yn 'e memmetaal, sels yn' e oanwêzigens fan detergenten.Bewiis út kristal- en molekulêre struktuerstúdzjes jouwe oan dat it enzym heart ta de subtilisine-famylje mei in aktive site-katalytyske triade (Asp)39-Syn69- Ser224).De oerhearskjende plak fan splitsing is de peptidebân neist de karboksylgroep fan alifatyske en aromaatyske aminosoeren mei blokkearre alfa-aminogroepen.It wurdt faak brûkt foar syn brede spesifisiteit.Dizze proteinase K is spesjaal ûntworpen foar mNGS.Yn ferliking mei de oare proteinase K, befettet it noch minder nukleïnesûrkontaminaasje mei deselde enzymatyske prestaasjes, wat de streamôfwerts mNGS-applikaasje better koe garandearje.
Storage Betingsten
2-8 ℃ foar 2 jier
Spesifikaasje
| Ferskining | Kleurleaze oant ljochtbrún flüssigens |
| Aktiviteit | ≥800 U/ml |
| Protein konsintraasje | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Gjin ûntdutsen |
| DNase | Gjin ûntdutsen |
| RNase | Gjin ûntdutsen |
Eigenskippen
| EC nûmer | 3.4.21.64(Rekombinant út Tritirachium album) |
| Isoelektrysk punt | 7.81 |
| Optimale pH | 7.0- 12.0 Fig. 1 |
| Optimale temperatuer | 65 ℃ Fig. 2 |
| pH stabiliteit | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 h) Fig. |
| Termyske stabiliteit | Under 50 ℃ (pH 8.0, 30 min) Fig. 4 |
| Storage stabiliteit | Mear dan 90% aktiviteit foar 12 moannen by 25 ℃ |
| Aktivators | SDS, urea |
| Inhibitoren | diisopropylfluorfosfaat;fenylmethylsulfonylfluoride |
Oanfraach
1. Genetyske diagnostyske kit
2. RNA en DNA ekstraksje kits
3. Ekstraksje fan net-proteïne-komponinten út weefsels, degradaasje fan protein-ûnreinheden, lykas DNAfaksins en tarieding fan heparine
4. Tarieding fan chromosome DNA troch pulsed electrophoresis
5. Western blot
6. Enzymatic glycosylated albumin reagents yn vitro diagnoaze
Foarsoarchsmaatregels
Draach beskermjende wanten en bril by it brûken of weagjen, en hâld goed fentilearre nei gebrûk.Dit produkt kin hûdallergyske reaksjes en serieuze eachirritaasje feroarsaakje.As ynademe kin it allergie of astma-symptomen of dyspnoe feroarsaakje.Kin respiratory irritation feroarsaakje.
Unit definysje
Ien ienheid (U) wurdt definiearre as de hoemannichte enzyme nedich om kasein te hydrolysearjen om 1 μmol te produsearjentyrosine per minuut ûnder de folgjende betingsten.
Reagents tarieding
Reagens I: 1g molke kasein waard oplost yn 50ml 0.1M natriumfosfaatoplossing (pH 8.0), ynkubeare yn 65-70 ℃ wetter foar 15 minuten, roer en oplost, koel troch wetter, oanpast troch natriumhydroxide nei pH 8.0, en fêst folume 100ml.
Reagens II: 0.1M trichloroacetic acid, 0.2M natriumacetat, 0.3M acetic acid.
Reagens III: 0,4M Na2CO3oplossing.
Reagens IV: Forint-reagens 5 kear verdund mei suver wetter.
Reagens V: Enzym diluent: 0.1M natriumfosfaatoplossing (pH 8.0).
Reagens VI: tyrosine oplossing: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tyrosine oplost mei 0,2M HCl.
Proseduere
1. 0.5ml reagens I wurdt foarwaarmd oant 37 ℃, foegje 0.5ml enzyme-oplossing ta, mingje goed en ynkubearje by37 ℃ foar 10 minuten.
2. Foegje 1ml fan reagens II ta om de reaksje te stopjen, goed mingje, en trochgean mei ynkubaasje foar 30mins.
3. Centrifugate reaksje oplossing.
4. Nim 0,5 ml supernatant, foegje 2,5 ml reagens III, 0,5 ml reagens IV ta, mingje goed en ynkubearje op 37 ℃foar 30 min.
5. OD660waard bepaald as OD1;blank kontrôle groep: 0,5ml reagent V wurdt brûkt om te ferfangen enzymeoplossing te bepalen OD660as OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. L-tyrosine standert kromme: 0.5mL ferskillende konsintraasje L-tyrosine oplossing, 2.5mL Reagent III, 0.5mL Reagent IV yn 5mL centrifuge buis, incubate yn 37 ℃ foar 30mins, detect foar OD660foar ferskillende konsintraasje fan L-tyrosine, dan krige de standert kromme Y = kX + b, dêr't Y is de L-tyrosine konsintraasje, X is OD600.
Berekkening
2: Totaal folume fan reaksje oplossing (mL)
0,5: Volume fan enzyme oplossing (ml)
0.5: Reaksje floeiber folume brûkt yn chromogenic bepaling (mL)
10: Reaksjetiid (min)
Df: Verdunning meardere
C: Enzymkonsintraasje (mg/ml)
Referinsjes
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biophys.Res.Commun.(1971);44:513.
3. Hilz, H.en oaren.,Eur.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2e edysje, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Figures
Fig.1 Optimaal pH
100mM buffer oplossing: pH 6.0-8.0, Na-fosfaat;pH 8.0-9.0, Tris-HCl;pH 9.0-12.5, Glycine-NaOH. Enzymkonsintraasje: 1mg/mL
Fig.2 Optimale temperatuer
Reaksje yn 20 mM K-fosfaatbuffer pH 8,0.Enzymkonsintraasje: 1 mg/ml
Fig. 3 pH Stabiliteit
25 ℃, 16 h-behanneling mei 50 mM bufferoplossing: pH 4.5- 5.5, Acetate;pH 6,0-8,0, Na-fosfaat;pH 8.0-9.0, Tris-HCl.pH 9,0-12,5, Glycine-NaOH.Enzymkonsintraasje: 1 mg/ml
Fig.4 Thermal stabiliteit
30 min-behanneling mei 50 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0.Enzymkonsintraasje: 1 mg/ml
Fig.5 Storage stability at 25 ℃
